Las enfermedades respiratorias se consideran una de las causas más frecuentes de muerte en humanos. La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), el asma y las lesiones pulmonares agudas están entre los principales problemas respiratorios en las personas. Según la Asociación Americana del Pulmón, el número de personas en Estados Unidos que padecen EPOC y otras afecciones respiratorias es de aproximadamente 37 millones. De hecho, actualmente hay cerca de 1,400 personas en espera de un trasplante de pulmón, y este número sigue en aumento. La gravedad de las enfermedades pulmonares en humanos se ve agravada por la falta de modelos animales que reproduzcan fielmente los problemas humanos. Por ello, es necesario desarrollar modelos in vivo y ex vivo para comprender mejor las bases biológicas de las enfermedades pulmonares y para probar nuevos agentes terapéuticos.
Los modelos ex vivo proveen una oportunidad para estudiar tanto la funcionalidad como la caracterización estructural de muestras. En este contexto, se vuelve evidente que desarrollar modelos ex vivo para la investigación sobre pulmones humanos donados está justificado.
Donor Network West está en una posición única por:
Los tejidos blandos, como los pulmones, colapsan fácilmente durante los cortes y el transporte. Sin embargo, el descubrimiento del método de Cortes de Pulmón de Precisión (PCLS, por sus siglas en inglés) se dió mediante la infusión de las vías aéreas de los pulmones con agarosa líquida caliente, que se solidifica en temperaturas menores a 25°C y, por lo tanto, tiene la ventaja de mantener la estructura de los tejidos. Entre los modelos ex vivo, la tecnología PCLS ofrece varias ventajas, incluyendo:
Las cortes de tejido pueden ser subsiguientemente cultivadas con candidatos de drogas o sustancias de prueba. Luego de varias horas o días, pueden observarse las respuestas del tejido. Por ejemplo, las vías aéreas en las piezas de tejidos pueden mostrar alteraciones microscópicas, o se pueden encontrar secreciones de moléculas indicativas. Además, pueden usar este modelo para el estudio de nuevas drogas - en las etapas iniciales del desarrollo de drogas.
Muestras de pulmones de donantes con consentimiento para la investigación con anormalidades pulmonares pueden ser recolectadas, fragmentadas y enviadas a cualquier parte de los Estados Unidos.
Rellenado de Agarosa:
Típicamente, la agarosa con un bajo punto de fusión se une en una concentración de entre 0.5 y 3%. Una vez en estado líquido a temperaturas mayores a 65°C, la agarosa se mantiene fluida si se mantiene a 37°C, solidificándose sólo cuando la temperatura baja de 25°C.
Se procuran los pulmones y se perfunden con 2 litros de solución salina o UW para eliminar la sangre. Luego, se rellena el lóbulo deseado con agarosa. La agarosa solidificada mantiene el pulmón en estado inflado y previene el colapso de las vías aéreas y alvéolos durante el proceso de corte.
Luego del relleno, el pulmón se sumerge en un medio helado, iniciando la rápida solidificación de la agarosa, seguida por el corte de precisión. En general, las piezas PCLS se preparan con un grosor de 100 a 500 μm. Este proceso resulta en piezas uniformes y repetibles, que pueden ser utilizadas en una variedad de protocolos y terapias experimentales ex vivo.
Las piezas preparadas se colocan en una incubadora. Típicamente, las piezas PCLS se sumergen en medio de cultivo en placas multipocillo a 37,5°C, 5% CO2 y humedad de 95 a 100% bajo condiciones de cultivo de tejidos, y el medio se cambia diariamente. El medio de cultivo ha sido optimizado para el suplemento con nutrientes esenciales, habilitando el cultivo de piezas PCLS por hasta 14 días, en comparación con reportes anteriores de la preservación de tejidos de solo 3 a 5 días. Asimismo, el agregado de antibióticos como la penicilina o la estreptomicina previene la contaminación de patógenos desde el inicio del cultivo. Durante el cultivo, las piezas PCLS se mantienen viables y mantienen actividad metabólica normal, homeostasis de tejido, integridad estructural, y respuestas a estímulos con lipopolisacáridos.
Siguiendo a la incubación, las piezas estarán congeladas y pueden ser enviadas a través de los Estados Unidos. En la práctica, el PCLS puede retener viabilidad comparable y homeostasis de tejidos, sea fisiológica o funcional, durante un período de cultivo de 1 a 3 días, aunque períodos más largos pueden alcanzarse con condiciones de cultivo optimizadas. Otra ventaja del PCLS es la posibilidad de almacenar muestras por criopreservación para uso futuro, lo cual es particularmente crucial para pacientes con condiciones excepcionales. Las piezas PCLS pueden ser criopreservadas a -80°C por largos períodos de tiempo. Siguiendo la criopreservación y el descongelamiento, las piezas retienen las funciones vitales de las células, habilitando la recolección de varios donantes/fenotipos antes de la experimentación.
Un resumen de la preparación de piezas PCLS en Donor Network West:
Siguiendo la procuración de pulmones autorizados para la investigación, son rellenados con agarosa, cortados en segmentos, y recortados en secciones de 100 a 500 micrones de grosor. En algunos casos, las piezas se mantienen en incubadoras antes de ser congeladas y trasladadas.
A summary of PCLSs preparation at Donor Network West:
Following the procurement of research authorized lungs, they are locally filled with agarose, cut into segments, and sliced into 100-500-micron-thick sections. In a number of cases, the slices will be kept in an incubator before freezing and shipping.
Más información acerca de muestras de investigación adicionales ofrecidas por el Programa de Investigación de Donor Network West.